TCR基因重排技术是检测淋巴细胞克隆性增生的金标准,应用于恶性淋巴瘤的早期诊断和鉴别诊断有重大意义,特别是对于经常规HE、免疫组化检测仍不能确诊的病例有较好的用途和前景。
TCR基因重排技术是检测淋巴细胞克隆性增生的金标准,淋巴细胞白血病呈单克隆异常增殖,其重排基因片段大小一致,经扩增后可见特异性条带。
TCR基因常作为细胞克隆特异性标志进行ALL细胞检测。
操作流程如下:
1、测序文库的构建
首先准备基因组,然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头。
如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。
2、锚定桥接
Solexa测序的反应在叫做flowcell的玻璃管中进行,flowcell又被细分成8个Lane,每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。
上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。
3、预扩增
添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增,单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。
通过变性,释放出互补的单链,锚定到附近的固相表面。
通过不断循环,将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
4、单碱基延伸测序
在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,在每一个测序簇延伸互补链时,每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。
5、数据分析
这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分,但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。
测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列,要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架,或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上,并进一步分析得到有生物学意义的结果。